Isolasi DNA Buah Tomat dan Pepaya

Tujuan

Tujuan dari praktikum kali ini adalah,

1. Untuk mengetahui cara/metode yang benar untuk memisahkan (mengisolasi) DNA dari buah-buahan.

2. Mengetahui keefektifan deterjen dan buah yang dipakai untuk melakukan percobaan isolasi DNA

Rumusan Masalah

Berdasarkan tujuan di atas, rumusan masalah dalam praktikum kali ini adalah:

1. Bagaimana metode yang benar dalam melakukan percobaan isolasi DNA?

2. Bagaimana kefektifan buah dan deterjen yang digunakan dalam praktikum isolasi DNA?

Dasar Teori

DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah master molecul (molekul utama) yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organisme (Jamilah, 2005). DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida (Istanti, 1999). Molekul DNA ini terikat membentuk kromosom, dan ditemukan di nukleus, mitokondria dan kloroplas. DNA yang menyusun kromosom ini merupakan nukleotida rangkap yang tersusun heliks ganda (double helix), dimana basa nitrogen dan kedua ”benang” polinukleotida saling berpasangan dalam pasangan yang tetap melalui ikatan hidrogen dan antara nukleotida yang satu dengan nukleotida yang lain dihubungkan dengan ikatan fosfat. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup dan disebut sebagai ”cetak biru kehidupan” karena molekul ini berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan struktur protein dan proses metabolisme lain (Jamilah, 2005).

DNA dapat mengalami denaturasi dan renaturasi. Selain itu DNA juga bisa diisolasi. Zubaidah (2004) dalam Jamilah (2005) menyatakan bahwa isolasi DNA dapat dilakukan melauli tahapan-tahapan antara lain: preparasi esktrak sel, pemurnian DNA dari ekstrak sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini karena adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sampel buah, maka kadar air yang pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda pula. Buah dengan kadar air tinggi akan menghasilkan isolat yang berbeda jika dibandingkan dengan buah berkadar air rendah. Semakin tinggi kadar air maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit.

Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Hal ini bertujuan untuk memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan. Proses ini harus dilakukan dengan hati-hati, sehingga tidak menyebabkan kerusakan pada DNA. Untuk mengeluarkan DNA dari sel, dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik dengan cara mekanik maupun secara kimiawi. Cara mekanik bisa dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dengan pemberian yang dapat merusak membran sel dan membran inti, salah satunya adalah deterjen.

Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat dilakukan karena deterjen dapat menyebabkan rusaknya mebran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membran membentuk senyawa ”lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia (Machmud, 2006).

Alat dan Bahan

Alat

1. Beaker glass atau gelas aqua
2. Pisau
3. Pengaduk
4. Penyaring (tissu / kapas)
5. Mesin blender
6. Spatula
7. Tabung reaksi dan rak tabung

Bahan
1. Buah (Tomat & Pepaya )
2. Deterjen ( Surf, Rinso) &sabun BuKrim
3. Aquades
4. Garam dapur
5. Etanol 96% dingin (Etanol & es Batu)

Prosedur Kerja

1. Melarutkan Deterjen ( Surf, Rinso) & sabun BuKrim ke dalam 60 mL aquades, diaduk pelan selama 15 menit.

2. Ambil 100 gram daging buah ditambah 100 mL aquades dimasukkan ke dalam mesin blender, kemudian diblender selama 40 detik.

3. Lalu campurkan 4 mL masing-masing larutan sabun dicampurkan dengan masing-masing 4 mL jus buah

4. Menambahkan 1 spatula garam dapur kemudian diaduk selama 10 menit sampai diperoleh campuran yang homogen.

5. Menyaring campuran yang dihasilkan pada point sebelumnya sebanyak dua kali

6. 6 mL hasil penyaringan pada point dia atas dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan menambahkan 5 mL etanol 96% dingin

7. Mengamati proses timbulnya DNA, meliputi waktu yang diperlukan, warna, serta banyak sedikitnya DNA yang terbentuk

Data Hasil Pengamatan

Tabel Hasil Pengamatan Isolasi DNA pada Buah

No	Buah	Perlakuan	Hasil Pengamatan
			Warna	Bentuk	Waktu	Jumlah
1.	Tomat	Surf	Putih	Benang	Lambat	++
		Bu Krim	Putih	Benang	Lebih cepat	+++
		Rinso	Putih	Benang	Sedang	+
2.	Pepaya	Surf	Putih	Benang	Lebih cepat	++++
		Bu Krim	Putih	Benang	Sedang	++
		Rinso	Putih	Benang	lambat	+++

Analisis Data

Praktikum isolasi DNA dilakukan bertujuan untuk mengetahui pengaruh macam buah dan jenis deterjen terhadap kualitas DNA yang dihasilkan dalam proses isolasi. Buah yang digunakan dalam proses isolasi DNA ini adalah buah pepaya dan tomat. Sedangkan jenis deterjen yang dipakai adalah deterjen bubuk Surf dan Rinso, serta Bu krim. Sumber DNA yang berupa buah diblender dalam waktu 40 detik. Pemblenderan ini bertujuan untuk merusak membrane sel, dinding sel dan membrane inti sehingga DNA bias keluar dari sel dan masuk ke larutan. Akan tetapi lama pemblenderan hanya dibatasi 40 detik karena jika terlalu lama dikhawatirkan molekul DNA akan ikut hancur. Setelah diblender, ekstrak buah ditambah garam dapur dan disaring 2 kali serta ditambah alcohol absolute. Penambahan garam dan penyaringan serta penambahan alcohol absolute bertujuan untuk memudahkan pemisahan benang-benang DNA dari larutan sehingga benang-benang DNA tersebut akan mudah diamati.

Setelah dilakukan proses pengisolasian DNA, didapatkan data bahwa pada penggunaan buah tomat sebagai sumber DNA, DNA yang berhasil diisolasi paling banyak ditemukan pada filtrate yang berisi larutan Bu krim. Sedangkan pada filtrate yang berisi larutan deterjen bubuk Surf, DNA yang didapatkan cukup banyak tetapi masih lebih sedikit jika dibandingkan dengan perlakuan sebelumnya. Pada filtrate yang berisi larutan deterjen bubuk Rinso DNA yang didapatkan cukup sedikit. Sedangkan waktu pembentukan DNA pada masing-masing perlakuan bervariasi. Untuk sumber DNA buah tomat, DNA paling cepat terbentuk pada larutan sabun Bu krim. Waktu paling lama yang dibutuhkan untuk mengisolasi DNA adalah pada larutan deterjen bubuk Surf.

Pada penggunaan sumber DNA buah Pepaya, DNA didapatkan paling banyak pada larutan deterjen bubuk Surf, sedangkan DNA yang sedikit ditemukan adalah pada larutan sabun Bu krim. Waktu pembentukan DNA pada masing-masing larutan jelas berbeda. Untuk larutan deterjen bubuk Surf, waktu rata-rata yang dibutuhkan untuk membentuk DNA lebih cepat, sedangkan pada larutan deterjen Rinso, waktu rata-rata yang dibutuhkan sedang dibandingkan dengan waktu rata-rata yang dibutuhkan untuk mengisolasi DNA pada larutan sabun Bu krim cukup lama.. Jd Waktu yang dibutuhkan untuk membentuk DNA tidak menunjukkan perbedaan yang nyata..

Jika dilihat secara keseluruhan, semua sumber DNA mampu menghasilkan DNA dengan cukup baik. Untuk masing-masing sumber DNA, jenis deterjen yang digunakan mempengaruhi banyaknya DNA yang dihasilkan dan waktu pembentukannya pun bervariasi. Bentuk DNA yang dihasilkan pada pengamatan kali ini adalah bentuk benang dengan warna secara umum adalah putih.. Adanya hasil warna dan perbedaan lama waktu yang dibutuhkan untuk menghasilkan DNA dipengaruhi oleh beberapa factor, selain karena masing-masing deterjen dan sumber DNA memiliki kemampuan yang berbeda-beda, perbedaan waktu ini juga disebabkan oleh kekurang telitian praktikan dalam mengamati DNA yang terbentuk.

Pembahasan

Isolasi DNA pada dasarnya dapat dilakukan dengan menggunakan berbagai macam sumber DNA yang dapat diperoleh dari hewan maupun tumbuhan. Upaya untuk mengeluarkan DNA dari sel dilakukan dengan merusak dinding dan membrane sel dan juga membran inti. Cara yang digunakan untuk merusak membran-membran tersebut sangat beraneka ragam, misalnya dengan pemblenderan atau penggerusan dengan mortal dan pistil. Selain perusakan secara fisik, membrane dan dinding sel dapat pula dirusak dengan menggunakan senyawa-senyawa kimia. Perusakan dinding sel dan membrane sel pada praktikum isolasi DNA kali ini dilakukan dengan cara pemblenderan selama 1 menit. DNA yang didaptkan dalam pengamatan kali ini adalah DNA yang berupa benang-benang halus sehingga hanya serupa kabut putih yang sangat lembut.

Apabila dilihat dari sumber DNA yang digunakan untuk pengisolasian ini, macam buah yang digunakan tidak menunjukkan perbedaan yang nyata. Masing-masing buah untuk sumber DNA menghasilkan DNA yang berbentuk benang-benang halus berwarna putih. Keempat macam buah yang digunakan dalam proses pengisolasian DNA kali ini adalah jenis buah yang memiliki kadar air yang tinggi. Tidak ada perbedaan yang ditunjukkan untuk perlakuan variasi jenis buah ini. Suatu sumber menyatakan bahwa dalam proses pembuatan sumber DNA untuk isolasi DNA hendaknya jangan terlalu encer karena semakin encer sumber DNA, DNA yang terpresipitasi akan semakin sedikit. Karena sel yang lisis di dalam air tentunya lebih sedikit jika dibandingkan dengan sumber DNA yang lebih kental (Anonim, 2005). Namun, masalah pengaruh keenceran terhadap hasil isolasi DNA dapat diatasi dengan pengurangan jumlah Akuades yang digunakan sehingga walaupun sumber DNA yang digunakan adalah buah dengan kadar air tinggi, tetap dapat diperoleh ekstrak yang cukup kental.

Membran sel pada setiap organisme dapat mengalami kerusakan yang disebabkan oleh pengaruh senyawa-senyawa kimia. Senyawa kimia yang mampu merusak membrane ataupun dinding sel antara lain lisozim yang mampu mempengaruhi kerja senyawa polimerik sehingga kekakuan sel tidak lagi dapat terjaga. Selain itu, ada pula senyawa EDTA (etilendiamintetraasetat) yang berfungsi untuk menghilangkan ion Mg²⁺ yang penting untuk mempertahankan struktur selubung sel serta menghambat enzim yang dapat merusak DNA. Dalam proses isolasi DNA, deterjen berfungsi menggantikan senyawa-senyawa kimia tersebut di atas. Deterjen mengandung sodium dodesil sulfat (SDS) yang dapat menyebabkan hilangnya molekul lipid pada membran sel sehingga struktur membrane akan rusak dan melisiskan isi sel (Jamilah, 2005). Pada pengamatan kali ini deterjen yang digunakan ada 2 macam, yakni deterjen bubuk, dan sabun krim. Dari kedua jenis deterjen tersebut, yang paling sedikit menghasilkan DNA adalah deterjen Rinso. Sedangkan larutan dengan deterjen bubuk Surf dan Bu krim menghasilkan DNA dengan jumlah yang cukup banyak. Kedua deterjen tersebut tidak dapat dibandingkan mana yang lebih baik dalam mengisolasi DNA karena pada setiap perlakuan menunjukkan hasil yang relatif sama.

Pengisolasian DNA menggunakan garam dapur dengan tujuan untuk memekatkan DNA. Hal ini dapat terjadi karena ion Na⁺ yang dikandung oleh garam mampu membentuk ikatan dengan kutub negative pada ikatan fosfat DNA. Saat ion Na⁺ garam berikatan dengan fosfat, pada saat itulah DNA akan berkumpul. Sedangkan penambahan alcohol pada permukaan larutan betujuan untuk melakukan presipitasi sehingga DNA yang telah terkumpul tadi mampu memisah dari larutan dan terbentuklah lapisan-lapisan yang dapat diidentifikasi unsur penyusunnya.

Diskusi

1. Teknik isolasi DNA, merupakan suatu cara/metode untuk memisahkan DNA dari sel, baik dari inti, mitokondria maupun kloroplas.

2. Garam: Menyebabkan protein dan karbohidrat terpresipitasi ke dalam larutan yang kemudian tersaring pada proses penyaringan, serta berperan sebagai ”lysing buffer”, yakni menjaga pH larutan agar tetap konstan, sehingga diharapkan tidak terjadi denaturasi DNA.

Pemblenderan: Merusak dinding sel secara mekannik sehingga DNA dapat keluar dari dalam sel.

Deterjen/sabun cair/sabun krim: Merusak membran sel dan membran inti sehingga DNA yang diinginkan dapat dikeluarkan dari dalam sel.

Penyaringan: Agar komponen sel selain DNA tidang mengkontaminasi DNA yang hendak diisolasi.

Etanol: Mempresipitasikan asam nukleat polimerik dengan baik untuk meningkatkan konsentrasi DNA.

3. Pada saat pengadukan harus pelan-pelan karena deterjen mudah sekalu berbusa,. Busa yang ditimbulkan oleh deterjen akan mengganggu pengamatan, karena DNA yang berhasil diisolasi nampak tipis, dan dapat dipastikan lapisan DNA tersebut akan tertutupi jika terdapat banyak buih.

4. Blender disini digunakan untuk memecahkan sel-sel secara mekanik. Jika proses pemblenderan dilakukan terlalu lama, dikhawatirkan tidak hanya memecahkan sel tetapi juga akan mencabik-cabik DNA, sehingga DNAnya hancur. Sedangkan jika terlalu sebentar, sel-sel belum seluruhnya terpacahkan.

5. Ethanol berfungsi untuk memperitifikasi DNA. Ethanol dingin akan mempercepat proses tersebut.

6. Hasil isolasi DNA sangat dipengaruhi oleh jenis buah dan deterjen yang digunakan. Terbukti dari hasil pengamatan, pada masing-masing buah didapatkan hasil yang berbeda, begitu pula ubtuk masing-masing jenis deterjen yang digunakan.

KESIMPULAN

Kesimpulan yang dapat diambil dari analisis data dan pembahasan di atas adalah:

1. DNA dapat diisolasikan dari sumber DNA berupa buah dengan penambahan larutan deterjen dan etanol serta garam untuk membantu presipitasi DNA. Perbedaan jumlah DNA yang dihasilkan dalam proses isolasi disebabkan oleh jenis deterjen yang digunakan serta macam buah yang dipakai sebagai sumber DNA.

2. Deterjen yang paling sedikit menghasilkan DNA adalah deterjen Rinso, sedangkan kedua deterjen yang lain (deterjen bubuk Surf dan sabun Bu krim ) menghasilkan DNA dalam jumlah yang relatif sama. Waktu pembentukan DNA yang paling cepat dihasilkan oleh sumber DNA buah tomat .

Related Posts